微流控免疫芯片在病原菌快速檢測中的研究.pdf

病原菌的常規檢測包括非選擇性和選擇性培養、生化反應和血清學鑒定等步驟其操作繁瑣周期長()費時費力不能滿足當代社會對環境、食品安全監督和傳染性疾病快速診斷的需要。近年來隨著生物技術的發展而建立起來的快速檢測技術(如免疫分析技術、技術等)雖然能夠在較短時間內鑒定病原菌但仍存在如靈敏度較低、假陽性和假陰性率高、操作復雜、成本昂貴等缺陷因此發展能夠準確、敏感、快速地檢測病原菌的技術方法刻不容緩?！　∥⒘骺匦酒鳛樾鲁霈F的微分析技術平臺以其結構縮微化、功能集成化、樣品和試劑耗量低、高通量輸出、分析時間短、易于便攜和自動化等優勢近年來在微生物檢測中的發展非常迅速。但現有的微流控芯片微生物檢測的研究主要是針對微生物研究中的某一單元或步驟如富集分選、預處理或分離檢測展開的缺乏集樣品處理、稀少樣本富集分選和檢測于一體的整合技術或方法整個研究也處于起步階段。而如何將病原菌檢測各個環節的操作過程集成于一張微流控芯片上并形成自動化的病原菌檢測系統是當今微流控芯片用于病原菌檢測所面臨的挑戰?！　¤b于當今社會對病原菌快速檢測的要求和現有檢測技術的缺陷本研究構建了一個微流控免疫分析芯片在芯片上開展了病原菌的分選富集和生物發光檢測研究。微流控芯片免疫分選技術具有抗體和試劑耗量低、反應速度快、易于集成和實現自動化的優勢:而以具有納米至微米級尺寸粒徑的微珠作為抗體的固相載體不但可以增大抗原抗體反應的比表面積而且其易于填充和更換的特點可以使芯片各單元功能更加分明另外芯片構型簡單、價格低廉易于構建和普及。利用螢火蟲熒光素蟲熒光素酶體系的生物發光分析對微生物進行定量可因光子產生率高而達到極高的靈敏度不需光源和復雜的光路也無需對微生物進行標記即可得到微生物數量和活性的信息是可集成于微流控芯片上的理想檢測方法?！　∫虼吮狙芯恳?為檢測目標將針對該細菌的高特異性和高捕獲率的免疫微珠富集腔設計于芯片微通道中并采用生物發光體系對富集到的細菌進行在線定量分析建立了集高特異性捕獲富集和高靈敏度檢測為一體的病原菌快速檢測法?！　⊙芯渴紫雀鶕嶒災康脑O計玻璃微流控芯片的微通道構型和尺寸芯片包括流體傳輸、免疫捕獲和發光檢測三個功能性區域。通過模塑法完成了芯片的制作并對制作工藝和封接方式進行了優化?！　∑浯瓮ㄟ^對粒徑為μ的玻璃微珠表面進行硅烷化處理和抗:多克隆抗體的共價連接完成了玻璃微珠的生物功能化修飾。將玻璃微珠填充于芯片微通道的六邊形腔內通過探索微珠傳輸流速和方式構建了一個呈單層均勻排列的芯片免疫微珠富集腔。并在熒光顯微鏡下觀察經吖啶橙染色的:在芯片內的捕獲進而驗證了免疫富集腔能夠有效捕獲富集到細菌。利用平板培養計數法評價了芯片免疫富集腔的捕獲效率通過對芯片進樣和沖洗的參數的優化使填充有免疫玻璃微珠的免疫富集腔對細菌樣品的實際捕獲率達到％～％?！　∽詈笸ㄟ^螢火蟲熒光素蟲熒光素酶體系和微弱發光檢測儀實現了對芯片內捕獲到的細菌的生物發光檢測并對芯片內發光反應的各種條件進行了優化。通過細菌濃度發光強度回歸方程的擬合建立了用生物發光反應的發光強度對細菌進行定量的方法。對方法的線性范圍、可靠性、重現性、穩定性和特異性進行評價證明了該微流控芯片病原菌檢測系統特異性高并能對豬肉樣品中的:進行準確定量?！　【C上所述本研究建立了一個特異性好、準確度高的微流控芯片病原菌快速檢測方法并且該方法可將整個病原菌檢測過程控制在以內為進一步開展病原菌的現場快速檢測系統的研制奠定了堅實的基礎。